Virulence et Infection Fongique Responsable : Mathias Lavie-Richard

PROGRAMME de RECHERCHE / THEMATIQUES

Les infections fongiques qui ont considérablement augmenté depuis les années 80 sont devenues aujourd’hui une préoccupation importante pour les établissements de soin étant donnés les moyens relativement pauvres de diagnostic et de traitement accessibles aux praticiens. Candida albicans est l’agent majoritairement identifié lors de ces infections et il est devenu par la même un organisme modèle des infections fongiques opportunistes. Cette levure, habituellement commensale, peut être à l’origine d’infections profondes mettant en jeu le pronostic vital. Or, l’incidence des candidoses profondes ne cesse d’augmenter parallèlement à l’augmentation du nombre de patients à risque. La virulence de C. albicans s’explique par sa capacité à coloniser puis envahir de nombreux tissus de l’organisme qui constituent autant de microenvironnements différents. Au sein de ces environnements ce pathogène interagit principalement avec 2 partenaires : les cellules de l’hôte et la microflore présente dans ces différentes niches de développement. Pour chacun de ces partenaires se développent deux types d’interaction (i) directement au contact des cellules de l’hôte ou de la flore bactérienne par l’intermédiaire de leur surface ; (ii) à distance grâce à des molécules secrétées dans le milieu extérieur. L’enjeu des recherches mise en place par notre équipe « Virulence et Infection Fongique » est d’identifier les molécules clef de ces 2 types d’interactions. Nous avons initialement ciblé les différentes interactions s’établissant au niveau de la surface cellulaire, en relation avec le partenaire le plus évident : les cellules de l’hôte. La première stratégie développée s’est basée sur de la génétique inverse portant sur les protéines à ancre GPI de C. albicans le groupe majeur des protéines de surface décrit à ce jour. Une banque de mutants pour chacun des gènes codant des protéines à ancre GPI putatives a donc été créée au laboratoire. La banque, terminée aujourd’hui, compte plus de 100 mutants. La stratégie a ensuite été de cribler ces mutants pour des phénotypes spécifiques évoquant des modifications de la biologie de C. albicans (hypersensibilité à des molécules de stress) ou des différences lors des interactions avec l’hôte (co-culture avec des macrophages, adhérence à des cellule épithéliales). En appuis de cette étude qui nous a permis d’identifier des gènes clefs des phénomènes étudiés nous avons développé des techniques biochimiques permettant de caractériser finement la localisation de ces protéines. En parallèle du décryptage du rôle de ces protéines de surface interagissant au contact de l’hôte l’équipe développe une seconde stratégie visant les molécules interagissant à distance. Dans ce cadre le projet en cours est de définir le secrétome de C. albicans et de produire et purifier chacune de ces protéines pour tester leur rôle sur les cellules de l’hôte. La description du secrétome de C. albicans fournissant une base de travail très puissante pour de nombreuses applications cliniques en particulier la recherche du pouvoir immuno-modulateur et immunogène de ces protéines et donc l’ouverture vers le développement de nouveau outils antifongique ou diagnostic.

- Les protéines à ancres GPI, structure et biosynthèse

Le glycosylphosphatidylinositol (GPI) est un glycolipide clé produit par tous les eucaryotes. Le GPI se lie de manière covalente au C-terminal de certaines protéines dans le lumen du réticulum endoplasmique. Cette modification post-traductionnelle permet la présentation de ces protéines à la surface cellulaire. La synthèse d'une ancre GPI fonctionnelle est essentielle pour (i) la formation de la paroi et la survie de levures telles que S. cerevisiae, C. albicans et S. pombe, (ii) le développement embryonnaire des cellules mammifères, (iii) la viabilité du parasite Leishmania mexicana et (iv) la forme sanguine de Trypanosoma brucei.

L’ancre GPI de tous les organismes a une structure de base très conservée. La partie C-terminale de la protéine est liée par une liaison peptidique, via un phosphoéthanolamine (P-EtN), à un tétra-saccharide de séquence : Mannose a(1-2) Mannose a(1-6) Mannose a(1,4) Glucosamine (M3-M2-M1-GlcN). Ce dernier est à son tour lié en a(1-6) à un inositol (cf. Figure ci-dessus). Enfin, l’inositol est attaché via un phosphate à un groupement lipidique hydrophobe qui permet à l’ancre de s’enchâsser dans la membrane et d’y former un réseau de liaisons hydrophobes assurant son attachement. Des modifications surviennent ensuite au niveau du groupement des 3 mannoses ou du groupement lipidique en fonction de chaque organisme (dans le Golgi lors du transfert à la surface).
La protéine produite au cours de sa translocation dans le RE est ensuite attachée à l'ancre au sein du lumen pour ensuite suivre la voie de sécrétion et être localisée à la membrane plasmique. Chez les levure une partie des protéines sont coupées au niveau du  groupement GlcN pour être attaché covalemment aux sucres de la paroi.

- Le rôle des protéines à ancres GPI dans la biosynthèse et le remodelage de la paroi
L'étude du génome nous a permis de prédire l'existence de 105 protéines à ancres GPI putatives grâce à leur séquence. Un mutant double disrupté pour la grande majorité de ces gènes nous a permis de produire une banque de près de 100 mutants. Des tests pour leur sensibilité à des agents perturbants la paroi ont été effectué et ont permis d'identifier des gènes impliqués dans les phénomènes de remodelage de la paroi. En particulier nous avons fait le lien entre des sensibilité ou de la résistance à des agents ciblant la paroi et des protéines à ancre GPI, l'épaisseur de la paroi et la quantité de chitine la composant.



Fig : Epaisseur de la paroi des différents mutants identifiés lors de ce crible présenté en parallèle de la sensibilité de ces souches à la caspofungine (échinocandine). De même que pour le pourcentage en chitine il y a une corrélation très nette entre la sensibilité, l'épaisseur et le dépôt en chitine.

- Le rôle des protéines à ancre GPI dans l'interaction avec le système immunitaire
A l'origine de nos recherches sur les protéines à ancre GPI les premiers résultats ont été issus de l'étude du mutant gpi7-/-, un gène impliqué dans la modification de l'ancre GPI avant l'ancrage de la protéine dans le RE. Chez ce mutant la localisation à la paroi des protéines à ancre GPI est grandement modifié et perturbé ce qui implique une importante secrétion de protéines normalement localisées à la paroi. Ce mutant montre une baisse de sa virulence en modèle murin d'infection systémique. Afin de comprendre les modifications qu'engendrait cette mutation sur la reconnaissance par le système immunitaire nous avons engagé une étude en collaboration avec une équipe espagnol sur ces phénomènes.


Dans cet exemple on montre que le mutant gpi7-/- est reconnu beaucoup mieux par les macrophages murins (lignées primaires ou J774) que la souche sauvage et cela indépendamment des récepteurs TLR2 ou TLR4. 

- Analyse de la localisation et de la fonction de la plus grand famille des protéines à ancre GPI de C. albicans : la famille des Iff
La famille des IFF est la plus grande famille de protéines à ancre GPI chez C. albicans. Elle est composée de 12 membres dont au moins 1 membre est en fait secrété et non retenu à la surface : Iff11. La fonction de ces protéines est pour le moment incnnu bien que leur implication dans la virulence de ce pathogène ai été démontré à plusieurs reprise avec l'étude d'Hyr1, Iff11 et Iff4. Dans l'équipe nous nous sommes attaché à décrire la localisation de ces protéines ainsi qu'à étudier leur régulation transcriptionnelle.



Les exemples présentés ici sont les images de microscopie en immunofluorescence de souches portant chacun des Iff etiquetté avec un tag-V5. Les images ont été obtenues grâce à un anticorps anti-V5 conjugé à un fluorochrome avec des cellule simplement fixée et non perméabilisés. On montre ici la localisation à la surface d'Iff2, Iff3, Iff6. Iff8 semble elle être assez peu accessible de l'extérieur en raison d'un enchâssement probablement plus profond dans les sucres de la paroi.

- Le secrétome de C. albicans et son rôle dans l'interaction avec son environnement

Nous proposons ici d’explorer un domaine très peu connu de l’infection à C. albicans qui est le rôle des protéines excrétées lors des différentes phases amenant à la colonisation des organes profonds. L’étude de cet « excrétome » sera aussi l’occasion d’identifier des cibles potentielles pour le développement d’outils de diagnostic nouveaux. Le projet se décline en quatre étapes : (i) l’identification d’un sous-ensemble de l’excrétome de C. albicans à étudier en priorité en croisant des données de séquence, de transcriptomique et d’analyse phylogénétique ; (ii) la production et la purification de ces protéines ; (iii) l’utilisation de ces protéines pour la création d’une macro-puce à protéine et l’identification des protéines ayant un fort potentiel diagnostic ou vaccinal ; (iv) l’utilisation des protéines purifiées dans des modèles d’interaction cellulaire in vitro pour détecter celles ayant des actions immuno-modulatrices.