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Biofilms de Clostridium difficile

En bref …

Clostridium difficile est une bactérie anaérobie capable de sporuler et un entéro-pathogène qui pose un problème de santé publique. Il provoque, après des traitements antibiotiques déséquilibrant la flore intestinale, des colites et des diarrhées difficiles à traiter, récidivantes et avec un taux de mortalité élevé.  Nous étudions la capacité de C. difficile de former des biofilms qui pourraient participer à la colonisation et à la persistance chez l’homme et l’animal.

Contexte et Enjeux

C. difficile est responsable de pathologies allant de la diarrhée simple à des formes sévères, comme la colite pseudo-membraneuse et le mégacôlon toxique. Aux USA, 450000 cas et 29000 décès ont été dénombrés en 2011, et depuis 2013, C. difficile est considéré comme un pathogène résistant aux antibiotiques qui constituent une menace urgente. C’est la première cause de diarrhées nosocomiales en France, avec un coût annuel estimé à 163 millions € en 2011. C. difficile est aussi responsable d’infections communautaires en nombre croissant, et de diarrhées associées aux antibiotiques chez la plupart des animaux d’élevage. La forme infectieuse, la spore, qui se transmet facilement en contexte hospitalier, est aussi présente de façon ubiquitaire dans l’environnement, le sol, l’eau et les aliments. Le potentiel zoonotique des infections à C. difficile est de plus en plus étudié au niveau international.

Le cycle infectieux de C. difficile est complexe et présente plusieurs étapes. La germination des spores est suivie de la croissance des cellules végétatives et de leur expansion. L’infection culmine avec la production des toxines responsables des symptômes, et la sporulation permet la dissémination. La capacité de C. difficile à coloniser l’intestin est une étape importante encore mal connue. Depuis 2012, la communauté scientifique étudie les biofilms de C. difficile qui pourraient intervenir dans la colonisation des intestins et la persistance dans cet organe, ainsi que dans la chronicité et la récurrence des infections.

Résultat marquant : C. difficile  forme des biofilms d’architectures différentes

Notre équipe, en collaboration avec d’autres de l’Institut Pasteur et de l’INRA Micalis, ont récemment mis en évidence qu’in vitro, dans certaines conditions, C. difficile est capable de former des biofilms différents de ceux qui ont déjà été décrits. Au niveau macroscopique, après croissance en micro-fermenteurs, en présence d’un flux de milieu qui mime celui des fluides digestifs, on observe un biofilm immergé avec des macro-colonies. La comparaison de l’expression des gènes entre ce biofilm et une culture classique (planctonique) indique une large reprogrammation du métabolisme cellulaire et de l'exportation des protéines, notamment une faible expression des toxines. Ces résultats suggèrent que le biofilm mis en évidence ici, dont la fonction majeure ne semble pas être la production de toxines, pourrait plutôt servir de réservoir asymptomatique, à une étape précoce d’un cycle infectieux ou entre épisodes infectieux récurrents. Au niveau microscopique, après croissance en micro-plaques, récolte et fixation, les cellules du biofilm restent enchâssées dans un matériel polymorphe formant des agrégats robustes, résistant aux traitements de récolte et fixation, et de taille similaire aux agrégats qui ont récemment été décrits à la surface du mucus dans un modèle animal de colonisation (Soavelomandroso et al. 2017 Front Microbiol). Un marquage non invasif du biofilm intact in situ, dans les micro-plaques, révèle une architecture tridimensionnelle haute, éparse et constituée de façon hétérogène à la fois de micro-agrégats et de cellules individuelles. Cette architecture hétérogène est originale par rapport à celles des biofilms de C. difficile décrits jusqu’à présent (Vuotto et al. 2018 Adv Exp Med Biol; Pantaléon et al. 2014 Anaerobe; Dapa and Unnikrishnan 2013 Gut Microbes), et elle est pertinente, l’hétérogénéité étant une propriété bien connue des biofilms. Cette architecture pourrait favoriser les échanges avec l’environnement ainsi que la colonisation de structures en réseau, comme le mucus. Elle est complètement différente de celle obtenue après induction d’un gène sur-exprimé dans le biofilm formé en micro-fermenteur, le gène dccA. dccA est impliqué dans la synthèse du c-di-GMP, un messager de la formation de biofilms chez de multiples espèces dont C. difficile. Chez C. difficile, l’induction artificielle du gène dccA à un niveau très élevé, non seulement augmente la quantité de biofilms, comme attendu (Soutourina et al. 2013 Plos Genet), mais elle modifie aussi drastiquement son architecture : le biofilm est homogène, dense et peu épais. L’ensemble des résultats démontre pour la première fois que C. difficile est capable de former des micro-agrégats et des biofilms d’architectures différentes, avec une micro-agrégation des cellules qui peut être soit homogène et dense, en conditions d’induction forte de la production du c-di-GMP, soit hétérogène et éparse, en conditions plus physiologiques.

Perspectives

Au vu de l’ensemble de ces résultats, une des questions majeures qui se posent est celle du rôle des différents biofilms lors du cycle infectieux, chez l’homme ou l’animal infecté. Nos résultats ouvrent des perspectives d’étude de leurs différents biofilms, des mécanismes de leur formation, comme de leurs propriétés. Leur capacité à produire des toxines et leur résistance aux antibiotiques, qu’il s’agisse de ceux utilisés pour traiter les infections à C. difficile, ou de ceux dont l’utilisation constitue un facteur de risque, devront être évaluées. Ces recherches devraient permettre de mieux comprendre le rôle et l’importance des biofilms dans le cycle infectieux et ainsi d’élaborer des stratégies de lutte contre C. difficile plus efficaces.

Bibliographie

- Poquet I (corresponding), Saujet L, Canette A, Monot M, Mihajlovic J, Ghigo J-M, Soutourina O, Briandet R, Martin-Verstraete I, Dupuy B. 2018 Clostridium difficile biofilm: remodelling metabolism and cell surface to build a sparse and heterogeneously aggregated architecture. Front. Microbiol. Sep 12;9:2084. doi: 10.3389/fmicb.2018.02084. eCollection 2018. 

- Maikova A, Peltier J, Boudry P, Hajnsdorf E, Kint N, Monot M, Poquet I, Martin-Verstraete I, Dupuy B, Soutourina O. 2018 Discovery of new type I toxin–antitoxin systems adjacent to CRISPR arrays in Clostridium difficile. Nucleic Acids Res. 46 (9), 4733-4751. DOI: 10.1093/nar/gky124

Collaborations

- Bruno Dupuy et Isabelle Martin-Verstraete, LPBA, Institut Pasteur, Paris

Pour pouvoir démarrer ce projet souhaité par GME pour diversifier ses recherches, l’INRA, le Département MICA, l’Unité Micalis et l’Equipe GME ont donné à Isabelle Poquet l’opportunité d’une mise à disposition dans le laboratoire de Bruno Dupuy à l’Institut Pasteur, de façon à se former à l’étude d’une bactérie non étudiée à GME. La collaboration ainsi créée se poursuit pour développer l’étude de la formation de biofilms lors du cycle infectieux.

- Olga Soutourina, Université Paris-Saclay, Orsay

- Jean-Marc Ghigo, Unité de Génétique des Biofilms, Institut Pasteur, Paris

- Romain Briandet, B2HM, Micalis, INRA, Jouy-en-Josas

- Alexis Canette, Julien Deschamp et Christine Longin, plateforme MIMA2, Micalis, INRA, Jouy-en-Josas

- Claire Janoir, Faculté de Pharmacie, Université Paris-Saclay, Châtenay-Malabry

Projet antérieur : Lactococcus lactis, une usine cellulaire pour produire des protéines sécrétées

En bref …

Lactococcus lactis est une bactérie traditionnellement utilisée comme ferment dans l’industrie alimentaire pour fabriquer des fromages, mais aussi plus récemment comme usine cellulaire dans les domaines des biotechnologies ou de la santé. Nous avons développé, chez L. lactis, la production et la sécrétion de protéines à haute valeur ajoutée, sous une forme facile à purifier. Nous avons ainsi mené des recherches fondamentales sur la sécrétion et le contrôle de la qualité des protéines, mais aussi des recherches finalisées, pour améliorer le processus et nous avons pu breveter certains outils. Nous avons ainsi pu mener à bien la production efficace, avec un bon rendement, de protéines d’intérêt biotechnologique ou médical, sous une forme stable et active (bien repliée). Notre technologie brevetée a intéressé des industriels, avec qui nous avons construit des partenariats, dans le cadre de contrats de recherche et de licence.

Bibliographie

Articles

- Varela PF, Velours C, Aumont-Niçaise M, Pineau B, Legrand P, Poquet I. 2019 Biophysical and structural characterization of a zinc-responsive repressor of the MarR superfamily. PLoS One 14(2):e0210123. DOI: 10.1371/journal.pone.0210123

- Samazan F, Rokbi B, Seguin D, Telles F, Gautier V, Richarme G, Chevret D, Fernández Varela P, Velours C, Poquet I (corresponding). 2015 Production, secretion and purification of a correctly folded staphylococcal antigen in Lactococcus lactis. Microb. Cell Fact. Jul 16;14:104. DOI: 10.1186/s12934-015-0271-z

- Trémillon N, Morello E, Llull D, Mazmouz R, Gratadoux J-J, Guillot A, Chapot Chartier M-P, Monlezun L, Sole V, Ginisty H, Poquet I (corresponding). 2012 PpiA, a surface PPIase of the cyclophilin family in Lactococcus lactis. Plos One 7 (3):e33516. DOI: 10.1371/journal.pone.0033516

- Llull D, Son O, Blanie S, Briffotaux J, Morello E, Rogniaux H, Danot O, Poquet I (corresponding). 2011 Lactococcus lactis ZitR is a zinc-responsive repressor active in the presence of low, nontoxic zinc concentrations in vivo. J. Bact. 193 (8), 1919-1929. DOI: 10.1128/JB.01109-10  

- Trémillon N, Issaly N, Mozo J, Duvignau T, Ginisty H, Devic E, Poquet I. 2010 Production and purification of staphylococcal nuclease in Lactococcus lactis using a new expression-secretion system and a pH-regulated mini-reactor. Microb. Cell Fact. 9 :37.  DOI: 10.1186/1475-2859-9-37

- Morello E, Bermudez Humaran L, Llull D, Solé V, Miraglio N, Langella P, Poquet I (corresponding). 2008 Lactococcus lactis, an efficient cell factory for recombinant protein production and secretion. J. Mol.Microbiol. Biotechnol. 14 (1-3), 48-58. DOI: 10.1159/000106082

Brevets

- Poquet I, Gruss A, Bolotine A, Sorokine A. Bactéries à Gram-positif dépourvues d’activité HtrA et leurs utilisation-. Brevet délivré en France (FR2787810), en Europe (EP 1 141 337) et aux USA (US 6 994 997).

- Poquet I., Llull D. Cassettes d'expression procaryotes régulées par le zinc. Brevet délivré en France (FR 2843973), en Europe (EP 1 537 215) et aux USA (US 8,354,272).

- Poquet I, Ogier J-C, Leroy S. Procédé de détermination de l'espèce d'une souche de bactérie appartenant au genre Staphylococcus. Brevet N° 09 52773, délivré en France (FR 2 944 807)

Partenariats industriels     

- Bachra Rockbi, Sanofi Pasteur, Lyon : Contrat de Recherche (18 mois) : Production et sécrétion de deux antigènes recombinants par L. lactis

- Hervé Ginisty et Eric Devic, GTP-Technology, Labège: Deux Contrats de Recherche et Financements de thèse CIFRE (3 ans chacun), Contrats annuels de licence et sous-licence : Contrôle de la qualité des protéines à la surface de L. lactis et Production efficace de protéines sécrétées

Collaborations académiques

-     Paloma Fernandez Varela,  Synchrotron SOLEIL, Saint-Aubin

-     Gilbert Richarme, Institut Jacques Monod, Université Paris 7, Paris

-     Marie-Pierre Chapot-Chartier, Micalis, INRA, Jouy-en-Josas

Etudiants, Post-docs

- Frédéric Samazan, Ingénieur

- Nicolas Trémillon, PhD

- Eric Morello, PhD

- Daniel Llull, Post-doc, bourse Marie-Curie