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Responsables : Christina Nielsen-LeRoux & Leyla Slamti

THEMATIQUE ET PROJETS DE RECHERCHE

La problématique générale de l’équipe GME porte sur la compréhension du pouvoir pathogène et adaptatif des bactéries sporulantes appartenant au  phylum des Firmicutes,  notamment de celles qui constituent le groupe Bacillus cereus sensu lato ainsi que de Clostridium difficile afin de mieux connaître le danger qu’elles représentent pour la santé humaine.

Le groupe Bacillus cereus sensu lato regroupe des bactéries sporulantes taxonomiquement très proches capables de coloniser des hôtes aussi divers que les mammifères ou les insectes. Il comprend entre autres l’espèce B. thuringiensis (Bt), un micro-organisme entomopathogène utilisé comme biopesticide en raison de la production de protéines insecticides (toxines Cry) formant inclusion crsitalline, B. anthracis (Ba) l’agent responsable de la maladie du charbon, et B. cereus sensu stricto (Bc), une espèce responsable de toxi-infections alimentaires chez l’homme. Les spores de ces bactéries étant fortement adhérentes et largement répandues dans l’environnement, la contamination des denrées alimentaires et des équipements utilisés par l’industrie agroalimentaire sont des problèmes récurrents. Certaines souches du groupe B. cereus sont responsables  de toxi-infections alimentaires collectives (TIAC). Ces bactéries sont aussi des pathogènes opportunistes qui peuvent être responsables d'infections nosocomiales locales ou systémiques (endocardites, pneumonies, septicémies, endophthalmies).

Du fait de l’absence d’un modèle mammifère permettant d’évaluer le pouvoir pathogène d’une souche du groupe B. cereus par voie orale, l’étude de la virulence des souches du groupe Bacillus cereus sensu lato repose essentiellement sur l’utilisation de deux modèles : un modèle de toxicité cellulaire (cellules humaines HeLa et macrophages murins) et sur l’exploitation d’un modèle d’infection invertébré : la chenille du lépidoptère Galleria mellonella.

Au-delà du problème direct des TIAC et des infections à B. cereus, ce groupe bactérien constitue également un excellent modèle pour étudier la régulation de l’expression génétique, les capacités évolutives et adaptatives des bactéries pathogènes sporulantes ainsi que les facteurs impliqués dans l’émergence des pathogènes dans l’environnement.

Clostridium difficile (Cd) est, quant à lui, Cet opportuniste anaérobie strict capable d'émerger en cas de dysbiose du microbiote intestinal, une thématique importante de l’Unité Micalis. Il provoque des diarrhées post-antibiotiques et nosocomiales difficiles à traiter et dont la fréquence de récidive est élevée, et il représente un problème de santé publique majeur avec plus de 450 000 cas d’infections et 29 000 décès en 2011 aux USA. Nous avons choisi d’étudier la formation de biofilms par C. difficile qui pourrait jouer un rôle dans la colonisation, les infections récurrentes et les rechutes.

Sur le plan fondamental, les travaux de l’équipe GME s’articulent autour de 4 thèmes majeurs:

i)  la régulation de l'expression génétique;

ii) la persistance des bactéries sporulantes Bt/Bc et Cd dans l’environnement;

iii) la virulence de Bt et de Bc et l’émergence de nouvelles souches pathogènes;

iv) Les interactions hôte-pathogène-microbiote au cours du processus infectieux. 

En termes d’objectifs finalisés, l’ensemble de nos activités concerne trois problématiques:

i) la recherche de marqueurs pour la détection des souches pathogènes de Bc et le développement de kits de diagnostics;

ii) l’amélioration génétique des souches de Bt utilisées pour lutter contre les insectes nuisibles permettant de produire une nouvelle gamme de biopesticides plus respectueux de l’environnement;

iii) L’utilisation de Bt en tant qu’usine cellulaire pour la production de protéines.

Thématiques fondamentales

I- Régulation de l'expression génétique

1) Communication cellulaire

Etude des systèmes de communication cellulaire (ou quorum-sensing, QS) qui permettent aux bactéries de coordonner l’expression des gènes en réponse à la densité cellulaire et aux stimuli de l’environnement. Les recherches de l’équipe GME ont conduit à la caractérisation de la famille RRNPP des régulateurs de QS. Des travaux sont en cours pour étudier le fonctionnement du QS in vivo au niveau de la cellule isolée et pour caractériser des molécules permettant d’inhiber le QS (quorum quenching) et ainsi de réduire la virulence ou la sporulation des bactéries.

2) Transduction du signal

i) Les Hanks kinases

La phosphorylation des protéines est un phénomène ubiquitaire dans la transduction de signal. Les sérine/thréonine kinases bactériennes de type Hanks (STKs) sont impliqués dans de nombreuses voies de régulation, dont la virulence, la sporulation et la formation de biofilms. B. cereus et C. difficile possèdent deux STKs peu étudiées. Les résultats obtenus montrent que chez B. cereus, les STKs influencent notamment la sporulation, la germination, la formation de biofilm et la virulence. Chez C. difficile, les STKs jouent un rôle dans la résistance aux stress et aux antimicrobiens (Collaboration avec l’Institut Pasteur).

 ii) Les systèmes à deux-composants

Les systèmes à deux composantes permettent aux microorganismes de répondre aux changements des conditions environnementales. Ils se composent généralement d'une histidine kinase liée à la membrane qui détecte un stimulus environnemental spécifique et d'un régulateur qui agit en modulant l’expression des gènes cibles. Nous avons récemment identifié un système à deux composants qui contrôle l’expression des gènes cry chez une souche très particulière de Bt. Nous étudions le mode de fonctionnement de ce système, en particulier pour comprendre son rôle dans la différenciation cellulaire au cours de la phase stationnaire des bactéries.

Sequential activation of the quorum-sensing systems and their involvement in the infectious process: During the early infection stage, PlcR is activated by its cognate peptide PapR and the PlcR/PapR complex switches on the virulence properties of the bacteria, resulting in the death of the insect. In addition, PapR turns on the activity of a second QS sensor called PlcRa, which controls cystein metabolism and resistance to oxidative stress. PlcR/PapR also activates the expression of nprR and nprX. In the absence of the peptide NprX, the third QS sensor NprR negatively controls sporulation by interacting with the phosphotransferase Spo0F, thus interupting the phosphorelay leading to the activation of Spo0A, the master regulator for entry into sporulation. This function of NprR is similar to that of the Rap phosphatases which are inhibited by the Phr peptides. Finally, the binding of NprX to NprR represses the negative function of this regulator on sporulation and activates genes involved in necrotrophism, thus allowing the bacteria to survive and eventually to sporulate in the insect cadaver. NprR/NprX also activates the transcription of papRa, a gene encoding a peptide showing similarity with PapR.

II- Persistance des bactéries dans l’environnement ou chez l'hôte

Bt, Bc et Cd peuvent emprunter différentes voies développementales et persister dans l’environnement ou chez l’hôte. Ces bactéries peuvent notamment former des spores et produire des biofilms.La production de biofilm intervient lorsque la bactérie est soumise à des stress tels que des carences en nutriments. Les biofilms présentent une forte résistance aux agents antimicrobiens et à la dessication, et ont des propriétés d’adhésion importantes. Ils sont connus pour être associés à des pathologies infectieuses chroniques.

1) Biofilms de Bt/Bc

 Une grande partie des propriétés des biofilms de Bt/Bc est conférée par la production par le biofilm d’une matrice polysaccharidique et protéique. Notre équipe s’intéresse au rôle des composants de la matrice du biofilm dans le développement de celui-ci, dans ses propriétés d’adhésion et dans sa contribution au pouvoir pathogène.

2) Biofilms de Cd

Nous avons montré que Cd, est capable de former, dans certaines conditions in vitro, un biofilm original par rapport à d’autres précédemment décrits. Nous cherchons à caractériser les propriétés (conditions de formation, composants de la matrice) de ce biofilm qui pourraient être pertinentes in vivo.

3) Mécanismes de survie in vitro et in vivo

Les bactéries du groupe Bacillus cereus peuvent réaliser un cycle de développement complet chez leur hôte en activant séquentiellement des gènes de virulence, de nécrotrophisme et de sporulation. Nous avons montré que la population isolée des cadavres d’insectes était hétérogène et nous avons identifié une sous-population capable de survivre dans le cadavre de l’hôte dans un état physiologique inconnu, alternatif à la sporulation. Nous menons des recherches visant à caractériser ce mode de vie qui n’a encore jamais été décrit chez les Firmicutes sporulants. Nous nous intéressons tout particulièrement à la survie des bactéries et à l’expression génétique en condition d’hypoxie.

III- Virulence de B. thuringiensis et de B. cereus sensu stricto et l’émergence de nouvelles souches pathogènes 

1) Souches Bc émétiques (projet PCRI Ceremet)

Etude du transfert et du rôle des plasmides dans l’écologie des bactéries.

2) Souches Bc cliniques (DIM, Anses et APHP) 

Analyse comparative des génomes et recherche des déterminants impliqués dans le pouvoir pathogène.

3) Souches Bc Biovar anthracis (DGA) :

Des travaux sont en cours pour étudier le transfert, la stabilité et l’expression des gènes plasmidiques en vue de déterminer si toute souche de Bc a la capacité de devenir une souche Bc de type Biovar anthracis. Ces travaux sont réalisés en absence des gènes de toxines et de capsules pour permettre des expérimentations en confinement C1. 

IV- Interactions hôte-pathogène-microbiote au cours du processus infectieux

1) Colonisation et réponse immunitaire de l’hôte

L’objectif principal de ce projet est de caractériser les mécanismes de résistance de Bt/Bc à l’immunité innée de l’hôte (peptides antimicrobiens), ainsi que les réponses immunitaires et physiologiques activées au niveau de la barrière épithéliale, suite à une infection par les bactéries du groupe B. cereus chez G. mellonella, chez la drosophile (Collaboration avec l’USJ Liban) et chez la souris (collaboration Université de la Plata, Argentine). Nous avons notamment démontré que la D-alanylation des acides téichoïques constitue un mécanisme efficace de résistance aux peptides antibactériens (PAMs) chez B. cereus et caractérisé un nouveau mécanisme utilisé par les bactéries pour échapper à la détection par les récepteurs de l’immunité innée. Nous nous intéressons également à la compréhension du rôle du microbiote intestinal dans la progression de l'infection chez l’insecte Galleria mellonella ainsi que chez la Drosophile.

2) Homéostasie du fer lors de la colonisation intestinale

Le fer est important pour le fonctionnement des cellules de l’hôte et du pathogène. Nous avons démontré qu’une protéine de surface et un sidérophore jouent des rôles importants dans la progression de l’infection chez G. mellonella notamment en utilisant le fer de la ferritine de l’hôte. Nous cherchons à déterminer plus en détails le rôle de ces facteurs et d’autres lors de la colonisation intestinale en fonction de certaines réponses (homéostasie du fer) de l’hôte, du niveau d’hypoxie et du type d’aliment.

Galleria mellonella (waxmoth larvae) a model host species to study infectious diseases: Top left: gavage of G. mellonella larvae with a B. cereus bacterial suspension using an automated syringe pump injector. Bottom left: visualization of a mixed culture of two B. cereus strains tagged by either the green fluorescent (GFP) or the red fluorescent (mCherry) proteins Top right: in vivo visualization of a B. cereus strain tagged by GFP during infection of larvae. Bottom right: microscopic analysis (1000X) of a histological section of G. mellonella intestine infected by B. cereus (dark purple ‘sticks’ colonizing the midgut intestinal epithelium) (C. Nielsen-Leroux and V. Sanchis, unpublished).

Objectifs finalisés

I- Recherche de marqueurs pour la détection des souches pathogènes et le développement de kits de diagnostic

Toutes les souches de Bc produisent un nombre important de toxines et d’entérotoxines. Cependant la plupart de ces souches sont environnementales et sans historique clinique ou de TIAC. Dans le cas des souches de B. cereus responsables de TIAC à syndrome diarrhéique ou des souches de B. cereus impliquées dans des cas cliniques, les effecteurs du pouvoir pathogène ne sont pas connus. Notre équipe recherche donc ces effecteurs et souhaite identifier des marqueurs de ces souches pathogènes de façon à disposer d’un outil de diagnostic utilisable en prévention.

1) Détection des souches pathogènes du groupe B. cereus

(Anses + APHP)

2) Développement de kits de détection

(Projet ToxDetect  EJP 2018 – 2021)

II- Amélioration génétique des souches de Bt pour la protection des plantes (LIA INRA/CAAS)

Création d’une nouvelle gamme de biopesticides (Projet BioSafe-SATT 2017-2020 et collaboration avec un laboratoire de la CAAS, Chine)     

III- L’utilisation de Bt en tant qu’usine cellulaire pour la production de protéines.         

Création de souches permettant la production de protéines hétérologues encapsulées et cristallisées (Projet BioCap -TWB 2018 - 2020)

EVALUATION REPORTS and POSTER PRESENTATION of the GME TEAM

CONTACTS

Christina Nielsen-LeRoux

INRA, UMR1319-Institut Micalis
Equipe GME
Tel: 33 (0)1 34 65 21 00

or

Leyla Slamti

INRA, UMR1319-Institut Micalis
Equipe GME
Tel: 33 (0)1 34 65 23 82