Un système acellulaire (cell-free) est un système in vitro qui permet de reconstituer des processus biologiques tels que la transcription et la traduction. Il est composé des machineries transcriptionnelles et traductionnelles complétées par un mélange réactionnel (buffer) et une matrice d’ADN ou d’ARN. On distingue deux types de cell-free selon l’origine des machineries : les systèmes à base de lysat (CFS) et ceux composés d’éléments purifiés. Comparé aux cellules vivantes, les principaux avantages du cell-free sont la facilité d’utilisation à haut débit (volume de 1 à 10 µL), le contrôle sur la composition (pH, concentration des composés, etc.) et le découplage entre expression et croissance. Ces propriétés ont fait des systèmes cell-free des outils plébiscités pour la production de protéines (notamment toxiques), le prototypage de circuits synthétiques, la biodétection, la construction de cellules artificielles et l’enseignement. Les CFS sont également des outils précieux pour l’étude des mécanismes du vivant, comme l’a illustré dès les années 1960 le travail fondateur de Nirenberg et Matthaei sur le déchiffrement du code génétique. Ceci met en évidence la pertinence des CFS comme outils d’étude du vivant et soulève la question de leur utilisation pour disséquer la régulation génique.

La régulation des gènes est un processus complexe nécessaire à la survie des organismes dans des environnements variables. Ces régulations sont étudiées in vivo notamment grâce au séquençage direct d’ARN (DRS), une des méthodes de transcriptomique actuelles les plus informatives. L’adaptation du DRS au CFS permettrait de surmonter plusieurs limites associées au DRS in vivo, comme le contrôle restreint des conditions intracellulaires et la nécessité que l’organisme d’intérêt soit cultivable. L’objectif de cette thèse a été de développer une preuve de concept de l’utilisation des approches transcriptomiques en CFS. Cet objectif a été décomposé en deux étapes : (1) optimiser le CFS pour produire une quantité d’ARN suffisante pour des analyses par DRS et (2) exprimer le génome d’un organisme modèle afin d’évaluer la pertinence de l’analyse par transcriptomique en CFS. Nous avons ciblé l’optimisation du buffer d’un CFS basé sur un lysat d’Escherichia coli contenant l’ARN polymérase du phage T7 (T7 RNAP). Pour cela, nous avons mis en place un cycle d’active learning automatisé utilisant un plasmide rapporteur fluorescent permettant de quantifier simultanément la production d’ARNm et de protéines selon la composition du buffer. L’analyse de 653 réactions de CFS a conduit à l’identification d’un buffer optimisé produisant 20 fois plus d’ARNm que le buffer de référence. L’expression du génome du phage T7 dans ce système optimisé nous a ensuite permis de comparer le profil transcriptionnel obtenu en CFS à ceux mesurés in vivo ou dans un système minimal in vitro avec de la T7 RNAP purifiée. Alors que le système minimal reflète uniquement la production par la T7 RNAP, le CFS révèle un équilibre entre production et dégradation, ainsi qu’une maturation des ARN de T7 probablement due à l’activité de la RNase III présente dans le lysat. Un des mécanismes absents en CFS est la dégradation des ARN en 3’ observée in vivo, probablement à cause de mécanismes de dégradation inefficaces en lysat. La production, la dégradation et la maturation représentent des niveaux croissants de complexité biologique, du plus simple au plus complet. De premières expériences ont été conduites pour étendre notre preuve de concept à l’expression de génomes bactériens en développant des CFS contenant la RNAP des organismes d’intérêt.

Ce travail établit les bases d’une analyse transcriptomique in vitro à haut débit de la régulation génique bactérienne. L’analyse par transcriptomique en CFS pourrait permettre l’étude du paysage transcriptionnel de bactéries non cultivables.