Les enzymes à radical S-adénosylméthionine (SAM) constituent l’une des superfamilles d’enzymes à centres fer–soufre plus vastes et polyvalentes, capables de catalyser une remarquable diversité de transformations chimiques complexes. Présentes dans les trois domaines du vivant, elles participent à de nombreux processus biologiques, incluant le métabolisme primaire et secondaire, la biosynthèse de cofacteurs, la réparation de l’ADN et la modification post-traductionnelle de peptides ou de protéines. Parmi elles, les enzymes à radical SAM dépendantes de la vitamine B12 représentent un sous-groupe fonctionnel majeur, caractérisé par l’association d’une chimie radicalaire initiée par un centre [4Fe–4S] et de la réactivité organométallique de la vitamine B12. Malgré leur importance biologique, les bases moléculaires de leur catalyse, de la régulation du site actif et la reconnaissance des cofacteurs demeurent largement incomprises.

 

Ce travail de thèse combine des approches de biologie structurale, de biochimie et de spectroscopie afin d’étudier le mécanisme d’un représentant des enzymes à radical SAM dépendantes de la vitamine B12. Une plateforme cristallographique robuste a été développée pour capturer différents états catalytiques et piéger des intermédiaires réactionnels. Associées à la caractérisation biochimique des variants enzymatiques et à l’analyse fonctionnelle des différents cobamides, ces données offrent une vision intégrée du mécanisme de ces enzymes.

 

Les bases moléculaires de la sélectivité de l’enzyme vis-à-vis des cobamides ont été caractérisées par des approches structurales et biochimiques. Alors que l’enzyme soit capable d’accommoder des cobamides différents, l’efficacité catalytique est significativement impactée, démontrant ainsi que la structure du cofacteur module directement l’activité enzymatique. Les structures cristallographiques obtenues à haute résolution constituent la première caractérisation structurale d’une enzyme dépendant de la vitamine B12 en interaction avec des cobamides, apportant des informations inédites sur les mécanismes de reconnaissance des corrinoïdes.

 

Afin d’approfondir la compréhension du mécanisme enzymatique, une stratégie originale a été développée pour déterminer les structures d’une série d’intermédiaires réactionnels. Globalement, ils permettent de définir une trajectoire catalytique continue reliant la chimie radicalaire des enzymes à radical SAM au transfert de méthyle de type SN2 dépendant de la cobalamine. La caractérisation biochimique de mutants a montré que deux résidus de tyrosine hautement conservés jouent des rôles distincts mais complémentaires dans la catalyse. L’un est indispensable au bon positionnement de la molécule de SAM au sein du site actif, tandis que le second assure le couplage entre la coordination du substrat et de la SAM. Ensemble, ces résultats mettent en évidence un mécanisme de régulation du site actif, de la reconnaissance du substrat à l’initiation de la chimie radicalaire.

 

Dans son ensemble, ce travail apporte une compréhension inédite et approfondie du mécanisme des enzymes à radical SAM dépendantes de la vitamine B12 et met en évidence de nouveaux déterminants moléculaires gouvernant la reconnaissance des cofacteurs, la régulation du site actif et le contrôle de la catalyse.